小林桂

3 结语作者采用小鼠肠系膜淋巴结细胞和巨噬细胞模型，比较了LPX3和LPG2诱导细胞增殖和细胞因子分泌的活性。

超声波破碎仪，德国Bandelin公司。岩藻聚糖硫酸酯是褐藻和海洋无脊椎动物中常见的硫酸化多糖，含有大量的硫酸基团，可与带正电的壳聚糖通过聚电解质自组装的方式形成纳米粒子。

多糖完全酸水解：准确称取2mg样品，加入1mL三氟乙酸(2mol/L)，110℃降解6h，去除多余三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。1.2.5 壳聚糖-岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子(Cs-FucNPs)的制备配制1mg/mL的壳聚糖(Cs)溶液(0.2％醋酸溶液溶解)和岩藻聚糖硫酸酯(Fuc)溶液(蒸馏水溶解)。检测器采用示差折光检测器。流动相为CH3CN：PBS(磷酸盐缓冲液，pH6.7)=17:83(体积比)。乙腈(色谱纯级)，美国Tedia公司。

1.2.2 分子质量测定多糖分子质量的测定采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC法)。继续加入0.5mL亚甲基蓝溶液(0.4mmol/L)，混匀，放置5min，于波长560nm处测定吸光度。跨膜链的数量决定孔蛋白的拓扑结构，从而导致孔径的不同。

在5000r/min、4℃条件下离心20min，收集上清：于15000r/min离心40min，沉淀重悬于2g/100mLSLS中并在室温条件下孵育1h后，于15000r/min离心40min，沉淀即为外膜蛋白。外膜蛋白样品沸水浴5min，加样量为20L[16L蛋白溶液+4L(5)蛋白上样缓冲液]，80V电压进行样品浓缩，样品进入分离胶后加压至120V，当溴酚蓝即将跑出胶板时，停止电泳。被证实对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌效果Mazzarrino等针对肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌筛选出21种有抑菌活性的精油，发现肉桂的抑菌效果是有效的。单体孔蛋白由8～22个偶数跨膜链以反向平行方式通过相邻链间的氢键作用形成-桶状结构。

孔蛋白可以选择性地吸收各种营养物质，同时也能阻拦多种有害大分子物质进入细胞。试管内物质组成为8.9mLAPW、1mL菌液(分别为UG、OMDG和CWDG)和0.1mL不同质量浓度的肉桂醇溶液。

由于在临床治疗和水产养殖系统中广泛使用抗菌剂，副溶血性弧菌中耐药株的流行日益加剧，50％的临床和环境分离株具有耐多药性。肉桂醇是我国《食品添加剂使用卫生标准》中允许使用的食品香料。1.3.3 细胞膜完整性测定参考张赞彬等的方法，将菌悬液在4℃、3000r/min条件下离心15min收集菌体，磷酸缓冲液(pH7.0)清洗并重悬。细胞重悬于含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，缓慢加入EDTA溶液(pH8.0。

一直以来，细胞与外界环境的物质交换部位主要关注的是细胞质膜，近10年间研究人员才开始关注外膜，尤其是外膜蛋白在物质穿膜过程中的作用。37℃、130r/min培养12h，连续培养2代。1.3.7 外膜蛋白竞争试验考Lam等的方法进行外膜蛋白竞争试验，并作一定的改动。磷酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、氯化钠、碳酸氢钠，天津市风船化学试剂科技有限公司：常用药敏试纸，杭州滨和微生物试剂有限公司。

牛血清蛋白，北京索莱宝科技有限公司。另一部分菌体在4℃、3000r/min离心收集细胞，用SMM缓冲剂(20mmol/L马来酸盐、0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMgCl2，pH6.5)清洗2次，细胞重悬于SMM缓冲剂(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振荡30min，除去肽聚糖层，缓慢滴加EDTA溶液(pH8.0)使其终浓度为0.01mol/L，放入37℃的培养箱温育15min。

明确肉桂醇的作用靶点，为副溶血性弧菌的防控提供试验依据。其中很大一部分归因于沙门氏菌和副溶血性弧菌。

说明小分子穿过外膜主要通过孔蛋白同。未处理的菌体同样冷藏备用。以上培养基均121℃灭菌20min。37℃、100r/min振荡20min，获得一组除去外膜层的细菌细胞，留此阶段部分菌体冷藏备用perkinelmerv3酶标仪，成都必成丰瑞生物技术有限公司：UV-2550紫外-可见分光光度计。胶板考马斯亮蓝染色后置于凝胶成像系统拍照。

用0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)洗涤3次。外膜蛋白包括连接外膜层与肽聚糖层的脂蛋白和跨外膜的孔蛋白。

1.2 仪器、设备ZD-85A气浴恒温振荡器，金坛市科析仪器有限公司。肉桂醇、Tris、EDTA、硫酸粘杆菌素、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、SYBRGreenI、PI，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3.5 外膜蛋白的提取及质量浓度测定参考Chiu等的方法进行外膜蛋白的提取，并稍作修改。同时，副溶血性弧菌也是水生动物弧菌病爆发的病原体，给水产养殖业带来巨大的经济损失。

据估计，每年约有7600万人患病，5000人死于食源性疾病。明确肉桂醇的作用靶点，为副溶血性弧菌的防控提供试验依据。5804R高速冷冻离心机，Eppendorf中国有限公司。1.3.2 最小抑菌浓度测定采用二倍稀释法处理肉桂醇原液(质量浓度为1g/mL)，使其质量浓度依次为原液的1/2至1/2048。

1.3.3 细胞膜完整性测定参考张赞彬等的方法，将菌悬液在4℃、3000r/min条件下离心15min收集菌体，磷酸缓冲液(pH7.0)清洗并重悬。与外膜共同构成细胞壁。

将活化的菌液置于4℃、6000r/min离心收集菌体细胞。使肉桂醇终质量浓度为1/2MIC)，37℃下孵育2h。

另一部分菌体在4℃、3000r/min离心收集细胞，用SMM缓冲剂(20mmol/L马来酸盐、0.5mol/L蔗糖、20mmol/LMgCl2，pH6.5)清洗2次，细胞重悬于SMM缓冲剂(含1mg，mL溶菌酶)中，37℃、100r/min振荡30min，除去肽聚糖层，缓慢滴加EDTA溶液(pH8.0)使其终浓度为0.01mol/L，放入37℃的培养箱温育15min。细菌对现有抗生素已进化出多种对抗机制，如通过主动外排系统增强药物的外排作用，产生口一内酰胺酶使药物失去活性，或将药物作用的靶点加以修饰或改变等等，急需寻找具有新的作用位点且安全有效的替代防治策略。

细胞重悬于含有0.5mol/L蔗糖的0.01mol/LTris-Hcl(pH7.0)中，缓慢加入EDTA溶液(pH8.0。获得一组去壁的细菌细胞，将此原生质体冷藏备用。首先利用标准蛋白溶液绘制标准曲线，如图1所示。蔗糖、氯化镁、磷酸二氢钾、乙醇，天津市天力化学试剂有限公司。

利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定获得的外膜蛋白质量浓度。单体孔蛋白由8～22个偶数跨膜链以反向平行方式通过相邻链间的氢键作用形成-桶状结构。

在波长260nm处测定其吸光度值，即为菌液中核酸的含量。目前关于肉桂醇对副溶血性弧菌的抑制作用及机理的研究尚未见报道，本文采用肉桂醇作为抑菌剂探究细胞壁的缺失对副溶血性弧菌生物学特性的影响。

革兰氏阴性菌之所以很难找到有效的抑制药物，主要是因为其细胞的包膜结构较复杂。其中很大一部分归因于沙门氏菌和副溶血性弧菌。